Чи замінює гліфосат гліцин в білках активно діючих клітин ссавців?

автор: Стефані Сенефф

Оригінал: people.csail.mit.edu

[email protected]
18 серпня 2019 року

Нещодавно було опубліковано документ автором Антоніу та ін. із жирним заголовком “Гліфосат не замінює гліцин у білках активно діючих клітин ссавців”. [1]. Документ передбачав випробовування клітин раку молочної залози людини гліфосату протягом шести днів, а потім за допомогою вдосконаленої методики під назвою Tandem Mass Tag (TMT) для визначення коротких пептидів, які ніби містять аномально важкі молекули гліцину. Білки як оброблених, так і нелікованих клітин вводили за допомогою стандартного протоколу, що включає мас-спектрометрію, частковий протеоліз та подальший аналіз, як детально описано у статті.

Клітини підтримували в багатій поживній рецептурі під назвою Модифікований  Орел Дульбекко. Цей препарат є модифікацією оригінального Базального середнього орла, який в чотири рази збагачений амінокислотами та вітамінами. Він також має високу концентрацію глюкози – 4500 мг/л. Немає гарантії, що він не забруднений гліфосатом. Крім того, клітини вирощували в культурі протягом певного часу, який, можливо, накопичив значну кількість забруднених гліфосатом забруднених білків, які важко було очистити. Вони, ймовірно, розпочали своє життя в культурі вже із забрудненими гліфозатом білками, через все життя, що потрапляли до гліфосату людини, які спочатку перенесли ці клітини в пухлину молочної залози.

Автори випробували зразки для двох різних посттрансляційних модифікацій (ПТМ): модифікованого гліоксилатом цистеїну та заміщення гліфосату гліцином. Вони включали модифікацію гліоксилату, тому що вони висловлювали гіпотезу, що гліфосат може розпадатися на гліоксилат, який здатний зв’язуватися із залишками цистеїну. Зокрема, вони не виявляли ні цистеїнів, модифікованих гліоксилатом, ні в контрольних клітинах, ні в оброблених клітинах.

Навпаки, автори знайшли істотний сигнал про наявність гліфосату в кількох коротких пептидах в оброблених зразках. Однак вони також виявили не менш сильний сигнал у необроблених зразках. Вони писали: “Однак у цьому експерименті жоден із двох можливих ПТМ (посттрансляційних модифікацій), які представляють інтерес, не очікується при відсутності лікування гліфосатом. Таким чином, можна було використовувати маркування ТМТ для ідентифікації та фільтрації будь-яких потенційних помилкових відкриттів “. А потім: «Дані остаточно показують, що всі пептиди, що замінюються кандидатами, є помилковими відкриттями.»

Не менш правдоподібний аргумент, однак, полягає в тому, що “неліковані” клітини також містять білки, заміщені гліфосатом. Потенційно, більшість, якщо не всі пептиди, заміщені кандидатами, є справжніми відкриттями. Оскільки як оброблені, так і контрольні клітини протягом тривалого періоду перебували під дією гліфосату, правдоподібно, що вони накопичили протеїни, заражені гліфосатом, приблизно в однаковій кількості. Ентоні Самсель і я обговорювали в нашій першій статті про заміну гліфосату для доказів гліцину, що N-заміщені гліцини можуть утворювати пептоїди, які дуже важко руйнуються, і що було показано, що фосфонати мають властивість інгібувати протеоліз [2].

Ідея, що вплив гліфосату призводить до накопичення білків, стійких до протеолізу, підтримується дослідженням, опублікованим у 2013 році на рослинах гороху [3]. Автори спостерігали нагромадження всюдисущого протеїну разом з урегуляцією ферментів протеолізу, що дивно та незвично. Вони написали:

“Нагромадження повсюдних білків разом із посиленою передбачуваною активністю протеасоми спостерігалося за допомогою ABPP [Профілювання протеїну на основі активності], що вказує на роль протеасоми при лікуванні гербіцидом. Накопичення убиквитинованих білків зазвичай описувалося в поєднанні з супутнім зменшенням протеасомною активністю. Тим не менш, наші результати показали підвищення як рівня протеасоми субстрату, так і активності. Таким чином, спричинений гербіцидом стрес на протеомі може призвести до накопичення убиквитинованих білків, незважаючи на підвищену активність протеасоми, або збільшення доступності субстрату індукуючи активність протеасоми “.

Ймовірне пояснення полягає в тому, що вбудований у білки гліфосат порушує здатність протеолітичних ферментів до його руйнування. Насправді, у статті, що пов’язує гліфосат з аміотрофічним латеральним склерозом (ALS), ми описали, як гліфосат може порушити сам процес убіквітації, який позначає білки для делеції протеасомою [4]. Ми писали:

“Найбільш інтригуючим є той факт, що сам убіквітин критично залежить від висококонсервованої карбокси-кінцевої подвійної гліцинової пари для створення складних ланцюгів убиквітину, які сигналізують білку про деградацію [46] [ відтворений тут як [5] ]. Заміна гліфосату для будь-якого з цих основних гліцинів, як очікується, може погіршити процес переробки неправильно складених білків. Це може легко пояснити накопичення неправильно складених білків, що є відмітною особливістю ALS “.

На щастя для нас, Антоніу та ін. [1] надано у своїй таблиці 3 точні послідовності із замінами гліфосату, які були виявлені, і веб-сайт Uniprot пропонує інструмент, де можна знайти білки, що містять конкретні послідовності, використовуючи програмний пакет під назвою BLAST. Уніпрот зміг знайти ідентичність всіх 15 білків, поданих у вигляді малюнків на малюнку 3, з точною відповідністю послідовності, присутній у кожному білку. Всі 15 білків були білками людини. Щонайменше дев’ять цих білків зв’язуються з фосфатовключаючими молекулами, як перераховано в таблиці 1. Це забезпечує підтримку ідеї про те, що білки, які зв’язують фосфат, особливо чутливі до заміни гліфосатом, як це було сформульовано в недавньому документі, опублікованому Гунатілейк та ін. [6], припускаючи, що гліфосат є головним фактором хронічного захворювання нирок незвіданої етіології (CKDu) серед працівників сільського господарства Шрі-Ланки. Насправді, білкова синтаза EPSP у рослинах, яка, як вважають, є основною мішенню гліфосату при знищенні бур’янів, містить високозбережений залишок гліцину на місці, де фосфоенол піруват (PEP). Дослідники з DowDupont мали можливість використовувати технологію CRISPR для створення штаму кукурудзи, стійкого до гліфосату, через ген, модифікований CRISPR для синтази EPSP [7]. Перший крок, який вони зробили, – це змінити ДНК-код таким чином, щоб замінити гліцин на місці зв’язування PEP на аланін. Це призвело до версії ферменту, який був абсолютно нечутливим до гліфосату. 

Таблиця 1 : Дев’ять білків, що містять гліфосатзаміщені пептиди, визначені за допомогою інструментів спектрометрії Tandem Mass Tag (TMT). Ці пептиди разом із ще 6 були виявлені у ракових клітинах, вирощених у культурі. Усі дев’ять зв’язуються з молекулами, що містять фосфати, як зазначено в третій колонці. Перший стовпець надає виявлену послідовність, де “*” вказує залишок гліцину, який виявився заміщеним. Див.: Антоніу та ін. (2019) для детальної інформації про експериментальну установку.

ПослідовністьНазва білкаФосфатомісткий субстрат
AIRQTSELTLG * KБілок пальця цинку 624ДНК
DG * QDRPLTKINSVKЧлен сім’ї домену, що містить домен Pleckstrin, 5Фосфатиділінозитолфосфат
EPVASLEQEEQG * KПодвійний гомеобокс білка АДНК
G * ELVMQYKДіацилгліцеринокіназа гаммаАТФ
GKELSG * LG * SALKМітохондріальна специфічна ацил-КоА дегідрогеназа, що має специфічний довгий ланцюгFAD
KDGLG * GDKРецептор, пов’язаний з G-білком 158GTP
NEKYLG * FGTPSNLGKАТФ-залежна кліп-протеазаАТФ
RTVCAKSIFELWG * HGQSPEELYSSLKтРНК (гуанін (10) -N2) метилтрансфераза гомологтРНК
VTG * QLSVINSKБілкова О-манозил-трансфераза 2 (Q9UKY4)
Доліцилфосфат

Загалом, Таблиця 1 розкриває інтригуючий список людських білків, і багато з них, як очікується, будуть виражені в клітинах раку молочної залози. Наприклад, один є білком метилювання РНК (гомолог тРНК (гуанін (10) -N2) -метилтрансфераза). Інша функція супресорної пухлини здійснюється за рахунок інгібування Akt шляхом зв’язування з фосфатидилінозитолфосфатами (член групи 5 домену, що містить гомологію Pleckstrin). Інший – рецептор, пов’язаний з G-білком (GPCR). За даними Бар-Шавіта та ін., “GPCR контролюють багато особливостей пухлинного генезу, включаючи функції імунних клітин, проліферацію, інвазію та виживання на вторинній ділянці”. [8] Ще одним враженням є білок гомеобоксу, і цей клас білків, як вважається, відіграє причинну роль при раку молочної залози [9].

Ще одне важливе відкриття цієї роботи – це два білки, які були визначені статистично значно регульованими у відповідь на шестиденне лікування гліфосатом. Це: транслокаченість нуклеотидів ADP / ATP (ANT) та фактор сплайсингу, багатий серином / аргініном 6 (SRSF6) [1]. Ці два білки виявляються дуже цікавими, оскільки, як відомо, обидва мають надмірну експресію в пухлинних клітинах, і в обох випадках більш високий рівень цих білків пов’язаний із поганим результатом у хворих на рак.

SRSF6 є членом сімейства факторів сплайсингу, які мають потужні можливості змінювати експресію білка, модифікуючи спосіб збирання пептидів з окремих екзонів. Надекспресія SRSF6 в клітинах епітелію легенів посилювала проліферацію, захищала їх від хіміотерапії та підвищувала їх здатність утворювати пухлини [10]. Крім того, знищення SRSF6 у клітинних лініях раку легенів та товстої кишки зменшило їх туморогенний потенціал. SRSF6 часто експресується в раку шкіри, і він змінює сплайсинг білка, який називається тенасцином С, щоб сприяти інвазивному та метастатичному раку [11]. SRSF6 також викликає надмірну проліферацію кератиноцитів, характерну особливість псоріазу [12]. Якщо гліфосат спричиняє регуляцію SRSF6 у клітинах раку молочної залози, це, ймовірно, спричиняє посилений пухлиногенез у людей, що піддаються впливу.

ANT має декілька різних ізоформ з різним впливом на клітинну біологію, але ця, яка сильно виражена в клітинах раку молочної залози, – ANT2, і було показано, що вона важлива для підтримки виживання пухлини. Завдання ANT2 – транспортувати АТФ в мітохондрії, і ця діяльність важлива, коли клітина працює за припущеннями ефекту Варбурга. Ракові клітини виробляють багато своєї АТФ в цитоплазмі за допомогою гліколізу, а потім ANT2 переносить АТФ в мітохондрії, щоб вони могли зменшити кількість АТФ, необхідного їм для окисного фосфорилювання. Це хороша стратегія захисту від окислювального пошкодження, особливо коли мітохондрії можуть бути дисфункціональними через мутації ДНК, спричинені токсичними впливами. ANT2 насправді програмує клітину на реалізацію стратегій, що призводять до збільшення проліферації, а не апоптозу (загибелі клітин) за наявності стресорів [13]. Останнім часом існує інтерес до розробки препаратів, що борються з раком, пригнічуючи активність ANT2 [14].

Антоніу та ін.  стаття може бути суттєвим проривом у нашому пошуку процедури виявлення забруднення гліфосатом білками. Примітно, що їм вдалося ідентифікувати 15 людських білків, які, як виявляється, були модифіковані за допомогою заміщення гліфосатом на конкретний залишок гліцину. Цей документ має велике значення для громади взагалі, тому що він визначає встановлену процедуру, яка тепер може бути застосована досить рутинно на багатьох інших типах клітин, вирощених у культурі, а також на біологічних зразках, вилучених із хворих тканин ссавців, таких як нігті хворих на склеродермію, клітин шкіри у хворих на псоріаз, зразки волосся дітей, хворих на аутизм, копит коней, які страждають від загрузнення, біопсії пухлини, післясмертевого нападу Альцгеймера, захворювання тканини нирок та печінки тощо.

Майбутні можливості виявити забруднені гліфосатом білки збільшуються, і, як ми збираємо базу даних конкретних моделей заміщення, ми можемо навіть спрогнозувати правила щодо пептидних контекстів, де залишки гліцину особливо сприйнятливі, наприклад, коли сусідні амінокислоти невеликі (щоб запобігти стеричній перешкоді) або позитивно заряджені (для залучення гліфосату до місця збору пептидів через його негативний заряд). Дійсно, ці типи правил вже стають очевидними в невеликому наборі, знайденому Антоніу та ін. експериментами. Шість із 15 нібито заміщених гліцинів негайно супроводжувались позитивно зарядженою амінокислотою (лізин, гістидин або аргінін). І десять одразу передували одному з валіну, лейцину, серину або треоніну, всі вони є невеликими амінокислотами, що підтримують простір для метилфосфонільного хвоста гліфосату. Якщо гліфосат справді замінює гліцин під час синтезу білка, наслідки викликають розумові відхилення, і підступні кумулятивні токсичні ефекти гліфосату можуть легко пояснити зростання, яке ми спостерігаємо сьогодні, у поширеності довгого списку аутоімунних, метаболічних, неврологічних та онкологічних захворювань.

Список літератури

[1] М. Н. Антоніу та ін. Гліфосат не замінює гліцин у білках активно діючих клітин ссавців. BMC Res Notes 2019; 12: 494. (Веб-посилання)

[2] A. Самсел та С. Сенеф. Гліфосат, шляхи до сучасних захворювань V: Амінокислотний аналог гліцину в різних білках. Журнал біологічної фізики та хімії 2016; 16: 9-46. (Веб-посилання) (Завантажити)

[3] A. Зулет та ін. Протеолітичні шляхи, індуковані гербіцидами, які інгібують біосинтез амінокислот. PLOS ONE 2013; 8 (9): e73847. (Веб-посилання)
[4] С. Сенеф та ін. Чи сприяє гліфосат, який діє як аналог гліцину, АЛС? J Біоінфо Proteomics Rev 2016: 2 (3): 1-21. (Веб-посилання) (Завантажити)

[5] A. Зуін та ін. Убіквітінова сигналізація: Екстремальне збереження як джерело різноманіття. Клітини 2014; 3 (3): 690-701. (Веб-посилання)

[6] С. Гунатілак та ін. Синергетична токсичність гліфосату в поєднанні з іншими факторами як причина хронічної хвороби нирок невідомого походження. Int J Environment Res Public Health 2019; 16 (15). pii: E2734. (Веб-посилання) (Завантажити)
[7] Й. Донг та ін. Десенсибілізація рослинної EPSP-синтази до гліфосату: Оптимізований глобальний контекст послідовності забезпечує зміну гліцину на аланін в активному місці. J Biol Chem 2019; 294 (2): 716-725. (Веб посилання)
[8] Р. Бар-Шавіт та ін. G Рецептори, зчеплені з білком, при раку. Int J Mol Sci 2016; 17 (8). pii: E1320. (Веб-посилання)
[9] MT Льюїс. Гени Homeobox в розвитку молочної залози та неоплазії. Дослідження раку молочної залози 2000; 2: 159. (Веб-посилання)
[10] М Коен-Еліав та ін. Коефіцієнт сплайсингу SRSF6 посилюється і є онкопротеїном при раку легенів та товстої кишки. J Pathol 2013; 229 (4): 630-9. (Веб-посилання)
[11] М. А. Дженсен та ін. Фактор сплайсингу SRSF6 сприяє гіперплазії сенсибілізованої шкіри. Nat Struct Mol Biol 2014; 21 (2): 189197. (Веб-посилання)
[12] Х. Валдімарсон та ін. Псоріаз: захворювання аномальної проліферації кератиноцитів, індуковане Т-лімфоцитами. Імунол сьогодні 1986; 7 (9): 256-9. (Веб-посилання)
[13] Ш. Бейк та Ж. Лі. Транслокаченість аденінових нуклеотидів 2: новачки гравця раку. J Stem Cell Res Med 2016; 1 (2): 66-68. (Веб-посилання)

[14] Дж. Янг та ін. Пригнічення транслоказину аденінових нуклеотидів-2 на основі векторної siRNA в клітинах раку молочної залози людини індукує апоптоз та інгібує ріст пухлини in vitro та in vivo. Дослідження раку молочної залози 2008; 10 (1): R11. (Веб посилання)

Чи замінює гліфосат гліцин у білках активно діючих клітин ссавців? автор Стефані Сенеф ліцензований за ліцензією Creative Commons Attribution 3.0 United States .